Για τα υπό μελέτη είδη εντοπίστηκαν αυτοφυείς πληθυσμοί σε ολόκληρη την Ελλάδα (Κρήτη μέχρι Θράκη), πραγματοποιήθηκαν επισκέψεις και αρχικά επιλέχθηκαν 128 γενότυποι (ή γονότυποι) για το Cistus creticus, 62 γενότυποι για το Rosmarinus officinalis, 72 γενότυποι για το Salvia officinalis και 76 γενότυποι για το Rosa canina, ενώ στην πορεία επιλέχθηκαν και άλλοι γενότυποι για την ποιοτικότερη αναβάθμιση του έργου.
Τα επιλεγμένα φυτά σημάθηκαν με ετικέτες, με χαρτογράφηση της περιοχής και με προσδιορισμό γεωγραφικών συντεταγμένων με χρήση GPS. Τα μοσχεύματα μεταφέρθηκαν για ριζοβολία στον Φορέα ΑΝΘ/ΑΠΘ και ΓΚΛ και για ιστοκαλλιέργεια στο Φορέα ΑΝΘ/ΑΠΘ. Η συλλογή παραγωγικών γενοτύπων ολοκληρώθηκε με επιτυχία.
Έγινε πολλαπλασιασμός των φυτών με μοσχεύματα και ιστοκαλλιέργεια και ακολούθησε φύτευση τους στην ύπαιθρο για τη δημιουργία συλλογής. Χρησιμοποιήθηκαν μοσχεύματα βλαστού με φύλλα και μελετήθηκε η χρήση διαφορετικών υποστρωμάτων ριζοβολίας, καθώς και διαφορετικών συστημάτων ριζοβολίας. Ταυτόχρονα, μελετήθηκε ο in vitro πολλαπλασιασμός των ειδών από τον Φορέα ΑΝΘ/ΑΠΘ. Πραγματοποιήθηκε πλήρης φαινοτυπική καταγραφή όλων των μετρήσιμων παραγόντων που σχετίζονται με την παραγωγικότητα και την καλλωπιστική αξία των φυτών. Η φαινοτυπική καταγραφή έχει ολοκληρωθεί με επιτυχία σε όλα τα είδη.
Η γενοτύπιση με τη χρήση μοριακών δεικτών ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat) εφαρμόστηκε σε όλους τους γενοτύπους των ΑΦΦ, που συλλέχτηκαν και εγκαταστάθηκαν στις καλλιεργητικές συλλογές για την εξεύρεση της γενετικής τους απόστασης. Μέσα από τη γενετική ανάλυση σε επίπεδο γενοτύπου προέκυψε η γενετική συγγένεια μεταξύ των φυτών, καθώς και πολύτιμα συμπεράσματα για την βιοποικιλότητα των υπό μελέτη γενοτύπων.
Επίσης σε επιλεγμένους γενοτύπους έγινε γενοτύπιση με χρήση της μεθόδου ‘γενοτύπιση με αλληλούχιση’ (genotyping by sequencing, GBS), ή ddRAD, ώστε να εκτιμηθούν οι πολυμορφισμοί σε επίπεδο νουκλεοτιδίου (SNPs) και να εντοπιστούν εκείνοι, που υποστηρίζουν την επιλογή επιθυμητών χαρακτηριστικών. Μετά τον εντοπισμό των γενοτύπων που ενδιαφέρουν λόγω της υψηλής τους παραγωγικότητας σε ενεργές ουσίες ολοκληρώθηκε με επιτυχία η ΕΕ3.
EE4.1: Προσδιορισμός της αντιοξειδωτικής δραστικότητας των κλώνων όλων των γενοτύπων.
Ολοκληρώθηκε η διαδικασία προσδιορισμού της αντιοξειδωτικής δραστικότητας με τη χρήση των μεθόδων ανίχνευσης των συνολικών φαινολικών ουσιών (Folin-Ciocalteu) και της ολικής αντιοξειδωτικής δράσης (με τη χρήση DPPH ή εναλλακτικής μεθόδου). Η διαδικασία των μετρήσεων έδωσε αποτελέσματα που ποικίλουν σε κάθε είδος και μέσα από αυτά προκύπτουν γενότυποι με ισχυρή, μέτρια ή χαμηλή αντιοξειδωτικής δράσης.
ΕΕ4.2: Ανάπτυξη πρωτοκόλλων για τη χημική ανάλυση του C. creticus για τα LDs και τα PPs.
Στο είδος C. creticus προσδιορίστηκε η μεθοδολογία για τις χημικές αναλύσεις των 128 γενοτύπων, που αφορούν στην περιεκτικότητα ενεργών ουσιών σε νεαρά φύλλα με τη χρήση αέριας (GC/MS) και υγρής χρωματογραφίας (HPLC-MS/MS), αντίστοιχα. Συγκεκριμένα, σε λειοτριβημένα φύλλα έγινε εκχύλιση με διαλύτη εξάνιο για ανίχνευση των LDs και μεθανόλη για την ανίχνευση των PPs με τη χρήση LC-MS/MS. Τα αποτελέσματα ανέδειξαν τους γενοτύπους με μεγάλη παραγωγικότητα σε ουσίες LDs και PPs.
ΕΕ4.3: Ανάπτυξη πρωτοκόλλων για τη χημική ανάλυση των R. officinalis και S. officinalis για το CAΑναπτύχθηκαν τα πρωτοκόλλα για τη χημική ανάλυση των R. officinalis και S. officinalis για το καρνοσικό οξύ (CA).
Οι αναλύσεις ολοκληρώθηκαν επιτυχώς και έγιναν μέσω HPLC-DAD-MS σε δείγματα 1ου και 2ου σταδίου ανάπτυξης. Λόγω της χημικής αστάθειας του CA στο φως, στις υψηλές θερμοκρασίες και στους περισσότερους διαλύτες, έγινε επιλογή του κατάλληλου διαλύτη, τρόπου και χρόνου εκχύλισης. Αναπτύχθηκαν πρωτόκολλα ταχείας εκχύλισης με χρήση υπερήχων με ακετόνη που εξασφάλισαν τη γρήγορη και αποδοτική εκχύλιση των R. officinalis και S. officinalis. Επιπλέον έγινε βελτιστοποίηση της ανάλυσης HPLC-DAD-MS ώστε τα εκχυλίσματα να αναλύονται ταχύτατα, ώστε να μειώνεται στο ελάχιστο πιθανή απώλεια CA. Έχει γίνει επικύρωση της μεθόδου βάσει των προδιαγραφών ICH. Οι υπό μελέτη γενότυποι R. officinalis και S. officinalis αναλύθηκαν για την παραγωγικότητα τους σε CA και η διαδικασία ολοκληρώθηκε με επιτυχία.
Συνεπώς, ολοκληρώθηκε επιτυχώς η ΕΕ4.3.
ΕΕ4.4: Ανάπτυξη πρωτοκόλλων για τη χημική ανάλυση του R. canina για το ασκορβικό οξύ (ΑΑ) και τα PPs
Έγινε ανάπτυξη πρωτοκόλλων για τη χημική ανάλυση της Rosa canina, ως προς το ασκορβικό οξύ (AsA) και τα φαινυλοπροπανοειδή (PPs), καθώς και η κατασκευή εσωτερικής σύνθετης βάσης δεδομένων, ώστε να διευκολυνθεί η διεξοδική μελέτη του χημικού προφίλ του φυτού. Για το σκοπό αυτό, συλλέχθηκαν ώριμοι καρποί από αυτοφυή φυτά σε περιοχές της Β. Ελλάδος, από τους οποίους αφαιρέθηκαν τα αχαίνια. Όσον αφορά τη μέτρηση της περιεκτικότητας των ώριμων καρπών σε AsA, χρησιμοποιείται η ενζυμική μέθοδος της οξειδάσης του ασκορβικού οξέος, κατόπιν βελτιστοποίησης του πρωτοκόλλου.
Η μελέτη του φυτοχημικού προφίλ ως προς τα PPs, πραγματοποιήθηκε με υγρή χρωματογραφία (LC-MS) και κατόπιν δοκιμαστικών μετρήσεων και βελτιστοποιήσεων. Η διαδικασία μέτρησης των καρπών R. canina για AsA και PPs ολοκληρώθηκε με επιτυχία και έτσι εντοπίστηκαν οι παραγωγικότεροι γενότυποι. Συνεπώς, ολοκληρώθηκε επιτυχώς η ΕΕ4.
ΕΕ5.1: Συλλογή φυτικού υλικού, απομόνωση και αλληλούχιση RNA επόμενης γενιάς
Απομονώθηκαν ολικά RNA από γενοτύπους υψηλής και χαμηλής απόδοσης ουσιών ενδιαφέροντος από τα 4 είδη και Αλληλουχήθηκαν (RNA-seq) 24 RNA δείγματα από όλους τους γενοτύπους.
ΕΕ5.2: Διαφορική ανάλυση της έκφρασης των γονιδίων
Αναλύθηκαν βιοπληροφορικά τα 24 RNA δείγματα από όλους τους παραπάνω γενοτύπους. Πραγματοποιήθηκαν de novo assembly/χαρτογράφηση σε συγγενικό γονιδίωμα αναφοράς (R. canina), unigene functional annotation, unigenes CDS-TF predictions και τέλος DEG (μέσω του R Bioconductor package DeSeq2, με παραμέτρους Fold Change ≥2 και P adjusted value ≤0.05). Βρέθηκαν τα γονίδια που παρουσιάζουν διαφορική έκφραση στους δύο γενοτύπους των 4 ειδών υπό μελέτη, δίνοντας έμφαση στα γονίδια και μεταγραφικούς παράγοντες, που υπεισέρχονται στη βιοσύνθεση των ουσιών ενδιαφέροντος, και η γονιδιακή έκφραση τους επιβεβαιώθηκε με ποσοτική qPCR.
ΕΕ5.3: Λειτουργικός χαρακτηρισμός επιλεγμένων γονιδίων
Χαρακτηρίστηκαν γονίδια, που υπεισέρχονται στη βιοσύνθεση των LDs, PPs, μια CA από τα διάφορα ΑΦΦ.
Συνεπώς ολοκληρώθηκε επιτυχώς η ΕΕ5.
Τα φαινοτυπικά (ΕΕ2), γενοτυπικά (ΕΕ3), χημικά (ΕΕ4) και μεταγραφομικά (ΕΕ5) δεδομένα των γενοτύπων, ολοκληρώθηκαν και οι πληροφορίες των παραπάνω ΕΕ συγκρότησαν μια εσωτερική σύνθετη βάση δεδομένων, η οποία αποτελεί τη βάση για τη διερεύνηση της ύπαρξης συσχετισμών και τον προσδιορισμό γενοτύπων, που υπερέχουν συγκριτικά με άλλους στην παραγωγικότητα βιοενεργών ουσιών. Όλα τα δεδομένα εισήχθησαν σε αρχείο excel και η ΕΕ 6 ολοκληρώθηκε με επιτυχία. Έχουν εντοπιστεί μοριακοί/γονιδιακοί δείκτες, που συνδέονται με την συσσώρευση των ουσιών ενδιαφέροντος.
Συνεπώς, ολοκληρώθηκε επιτυχώς η ΕΕ6.
Χρησιμοποιήθηκε η τεχνολογία υπερκρίσιμης εκχύλισης με CO2 με προσθήκη διαφορετικών αναλογιών εκχυλιστών και σε διαφορετικές πιέσεις, που εφαρμόστηκε σε φυτικό υλικό από επιλεγμένους παραγωγικούς πληθυσμούς των τεσσάρων μελετούμενων ειδών. Ακολούθησε χημικά ανάλυση των εκχυλισμάτων.
Η ΕΕ7 ολοκληρώθηκε επιτυχώς, με τον προσδιορισμό των κατάλληλων συνθηκών εκχύλισης ανά είδος.
Μελετήθηκε η συχνότητα (κάθε 2, 4 και 6 ημέρες) και η χρήση NaCl σε τρία διαφορετικά επίπεδα (0, 100 και 200 mM) άρδευσης των φυτών. Στο τέλος των πειραμάτων προσδιορίστηκαν κρίσιμοι παράγοντές που επηρεάζονται από τη καταπόνηση των φυτών, όπως ο ρυθμός φωτοσύνθεσης, η χλωροφύλλη, ο φθορισμός χλωροφύλλης και μετρήθηκαν σε φύλλα οι ποσότητες LDs και PPs που παράγονται ή η αντιοξειδωτική τους ικανότητα. Έτσι προέκυψαν συμπεράσματα που αφορούν την επίδραση της άρδευσης και της αλατότητας του νέου σε σχέση με την παραγωγικότητα σε ουσίες ενδιαφέροντος.
Συνεπώς, ολοκληρώθηκε επιτυχώς η ΕΕ8.